Полезная информация о спермограмме

Спермограмма и ее основные параметры. Очень полезная статья

 

Бесплодный брак. Планирование семьи

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Бесплодный брак. Планирование семьи

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Infertility, family planning

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Многие украинские и российские репродуктивные клиники  (а также ряд частных клиник) в последние годы начали заниматься внутриматочной инсеминацией подготовленной спермой. Стоимость процедуры такова, что 4-6 инсеминаций сравнимы по стоимости с циклом ЭКО. Давайте разберемся как должна выполняться качественная инсеминация.

Первое, что хочется сказать, что не стоит делать инсеминацию при плохих показателях спермограммы — очень низкая эффективность при количестве сперматозоидов менее 10-15 млн. в мл, тем более при снижении подвижности и большом количестве морфологически аномальных сперматозоидов.

В клинике, которая занимается такой процедурой должна быть возможность криоконсервации спермы, т.к. для качественной подготовки иногда требуется большее количество эякулята, чем можно получить за один раз. Кроме того, нужно подгадать, чтобы сперма была готова к моменту овуляции или незадолго до нее, а это бывает сложно сделать без предварительной заморозки спермы.

Считается, что мужской фактор зависит в очень большой степени не только от показателей спермограммы, но и от наличия антиспермальных антител, а также наличия большого количества сперматозоидов с фрагментированным хроматином. Естественно, перед проведением ИИ с «подготовленной» спермой нужно сделать соответственно MAR-тест, а также SCSA или TUNEL. Если есть эти проблемы — бессмысленно делать инсеминацию по такой высокой цене.

И самое интересное — это подготовка спермы. Многие клиники (наши конечно) берут сперму, просто центрифугируют и добавляют среду. Но, по современным меркам это не подготовка, максимум что дает такая подготовка — избавляет от простагландинов и уменьшает вероятность болезненных сокращений матки после инсеминации. А в ряде случаев при центрифугировании могут повреждаться и нормальные сперматозоиды. Методами подготовки, которые действительно улучшают качество спермы, являются «Density Gradient Sperm Wash» когда сперматозоиды проходят через много слоев специальных дорогих сред, а также «Swim Up Technique» когда выбирают наиболее подвижные и жизнеспособные сперматозоиды, которые самостоятельно продвигаются через специальную вязкую среду.

И последнее — обязательно проведение повторной спермограммы полученной в результате подготовки спермы.

Вот поэтому в наших реалиях очень не часто, но иногда вполне благоразумно проведение инсеминации нативной спермой, т.к. у этой процедуры приемлемое соотношение цена/качество, а те осложнения о которых говорят (инфекция и анафилактический шок) крайне редки и в большинстве случаев предотвратимы. Это мое мнение. Оно адаптировано к нашим реалиям. Если вы нашли клинику, где гарантированно выполняются все этапы, перечисленные выше, показания для ИИ выбраны верно, вы можете расчитывать на кумулятивную эффективность (за 6 циклов) на уровне 20%.

 

С уважением,

Медведев М.В.

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Фрагментация ДНК в сперматозоидах человека (обзор литературы)

Е. В. Маркова  А. С. Замай

Фрагментация ДНК сперматозоидов является относительно недавно открытой, интенсивно исследуемой в последнее десятилетие причиной мужского бесплодия и отцовского эффекта нарушений раннего эмбрионального развития. Причинами разрывов ДНК считают процессы изменения структуры хроматина в ходе сперматогенеза и апоптоз. Для оценки фрагментации ДНК и апоптотических маркеров сперматозоидов в настоящее время разработан целый ряд методических подходов. Высокий процент сперматозоидов с повреждениями ДНК не всегда коррелирует с обычными параметрами спермограммы. В то же время фрагментация ДНК сперматозоидов может оказывать влияние на ранние этапы эмбрионального развития, особенно на формирование бластоцисты и частоту наступления беременности в циклах ЭКО/ИКСИ. Подходы к преодолению повышенной фрагментации в сперматозоидах человека начинают разрабатываться.

 


В настоящее время нарушениям отцовского генома уделяется все большее внимание в репродуктивной медицине. Использование классического анализа спермы, рекомендованного ВОЗ, не всегда позволяет выявить отцовский эффект, обусловливающий нарушения эмбрионального развития [1, 2]. Проблема целостности генома мужских гамет актуальна для диагностики и лечения мужского бесплодия, повышения эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и предотвращения передачи генетических дефектов при использовании ВРТ, особенно при инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ) [3, 4]. Отцовский эффект может быть связан с такими генетическими факторами, как генные мутации, микроделеции, анеуплоидии, эпигенетические нарушения, повреждения ДНК и нарушения компактизации хроматина [5-7].

Фрагментация ДНК сперматозоидов — относительно недавно открытая причина мужского бесплодия, которая интенсивно исследуется в последнее десятилетие [8-14]. Она включает двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК [6, 15].

Патофизиологические механизмы, ведущие к фрагментации ДНК, не вполне ясны, однако известно, что сперматозоиды человека часто имеют высокий уровень таких повреждений [16-18]. Предполагается, что их причиной могут быть нерепарированные повреждения ДНК, дефекты ремоделинга хроматина, возникающие в ходе сперматогенеза. Источниками фрагментации хроматина сперматозоидов в настоящее время также считаются апоптоз и окислительные процессы [15]. Комплекс этих явлений в сперматозоидах стал детально исследоваться лишь в последние годы и поэтому возникает еще много вопросов.

Для выявления повреждений хроматина сперматозоидов предложены различные методы, включающие технологии анализа разрывов ДНК, а также анализ маркеров апоптоза. Молекулярные методы, появившиеся за последние годы, могут служить инструментом для оценки состояния ДНК и прогноза качества эмбрионов и исходов ВРТ [9, 15, 19].

Разрывы ДНК в ходе формирования структуры хроматина сперматозоидов

в сперматогенезе

Хроматин (комплекс ДНК с белками) сперматозоидов организован особым, отличным от всех соматических клеток образом. ДНК сперматозоидов высоко конденсирована с помощью особых негистоновых белков — протаминов. Такая упаковка плотнее, чем упаковка ДНК в метафазных хромосомах, и образуется при формировании сперматозоидов [20]. В ходе сперматогенеза мужские гаметы образуются из прогениторных сперматогоний. Процесс разделяется на три основные стадии: премейотическую, мейотическую, постмейотическую. Специфические изменения хроматина, происходящие на разных этапах сперматогенеза, могут служить источником разрывов в ДНК [6, 21, 22].

Изменения хроматина в ходе премейотической и мейотической стадий

Первая стадия является пролиферативной. Сперматогониальная клетка претерпевает деление, в результате которого одна из дочерних клеток остается стволовой, а другая вступает на путь сперматогенеза. Премейотические сперматогонии делятся митотически. В этот период происходит активный синтез ДНК и образование различных типов сперматогоний. Они вступают в мейоз, формируя прелептотенные сперматоциты, и проходят все стадии мейоза I и быстро переходят в мейоз II, после прохождения которого формируются гаплоидные сперматиды. В пахитене мейоза хромосомы проходят через процесс гомологичной рекомбинации. Мейоз также характеризуется заменой соматических гистонов на тестисспецифичные [21, 22].

На пролиферативном этапе сперматогенеза гаметы особенно чувствительны к генотоксикантам окружающей среды. Нерепарированные изменения в ДНК сперматогоний могут фиксироваться в виде мутаций после репликации. В позднем сперматогенезе клетки не делятся. Известно, что репарация протекает активно на первом и втором этапах сперматогенеза с участием механизмов прямой репарации азотистых оснований и эксцизионной репарации нуклеотидов, в ходе которой возникают одно- и двухцепочечные разрывы полинуклеотидной цепи [21]. Для элиминации клеток с нерепарированной ДНК служит апоптоз.

Изменение хроматина в ходе постмейотической стадии

В ходе постмейотической гаплоидной стадии, при созревании мужских гамет происходит ремоделинг — изменение структуры хроматина, — который связан с потерей гистонов и их заменой на протамины. Это приводит к уплотнению хроматина и превращению его в достаточно уникальную структуру ядра сперматозоида. Феномен ремоделинга в сперматогенезе, открытый для всех млекопитающих, является наиболее глобальным изменением хроматина и самым радикальным из всех известных механизмов ремоделинга хроматина [23].

При ремоделинге гистоны сначала заменяются на специфические транзиторные белки, которые в дальнейшем заменяются на протамины — небольшие основные, богатые аргинином белки. Механизм контроля элиминации гистонов не вполне ясен. Пусковым механизмом служит модификация гистонов: специфическое метилирование, ацетилирование, фосфорилирование или убиквитинилирование [23].

В зрелых сперматозоидах ДНК с помощью протаминов упакована в частицы 50-100 нм, соединенные линкерными участками. В каждую такую частицу входит участок ДНК размером около 50 kb [24]. Согласно современной модели, такая частица формирует своеобразный тороид (см. рисунок ) [25].

У млекопитающих известны два типа протаминов: протамин I, характерный практически для всех видов, и протамин II, найденный лишь у некоторых видов, в том числе у человека [26]. Выявлено, что дефицит протамина II способствует повреждению ДНК сперматозоидов и гибели мышиных эмбрионов, полученных после ИКСИ [27]. Небольшая часть ДНК сперматозоидов (не более 15%) остается связанной с гистонами [6].

В ходе ремоделинга с участием топоизомераз возникают одноцепочечные и двухцепочечные разрывы, способствующие решению проблемы сверхспирализации ДНК. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что разрывы цепи ДНК характерны главным образом для постмейотического созревания при сперматогенезе, но недолго существуют в зрелых сперматозоидах. Таким образом, начало конденсации хроматина коррелирует с увеличением разрывов в ДНК. Затем разрывы репарируются. Предполагается, что лигирование разрывов обеспечивается транзиторными белками [28].

В процессе эпидидимального транспорта сперматозоидов тиоловые группы протаминов окисляются, образуя дисульфидные связи, стабилизируя ядро сперматозоида в еще более компактную структуру. Процесс уплотнения хроматина играет важное значение в формировании головки сперматозоида, инактивации транскрипции мужского генома, защите и стабилизации ДНК сперматозоида [23]. Таким образом, разрывы ДНК, возникающие в ходе ремоделинга, также рассматриваются как источник разрывов ДНК в сперматозоидах.

Апоптоз в ходе сперматогенеза

Присутствие разрывов в ДНК обычно служит ключевым индикатором апоптоза — программируемой клеточной гибели. Считается, что детектируемые на этапах репарации и ремоделинга разрывы ДНК могут быть не связаны с апоптозом. В то же время в ходе сперматогенеза элиминация половых клеток путем апоптоза является нормальным постоянным процессом, приводящим к уменьшению числа потенциально возможных сперматозоидов [29]. Предполагается, что апоптоз может выполнять две функции в ходе нормального сперматогенеза. Первая роль состоит в численном ограничении популяции сперматогониальных клеток, что обеспечивается клетками Сертоли. Второй функцией, по-видимому, служит селективная гибель аномальных сперматозоидов [6].

Тестикулярные клетки чрезвычайно чувствительны к апоптотическим стимулам, таким как высокие дозы химиотерапии [30]. Очевидно, высокий уровень повреждений в ДНК имеет решающее значение в судьбе сперматогенных клеток [21]. Среди генотоксических факторов окружающей среды наиболее хорошо документированным является курение. Курильщики имеют повышенный уровень разрывов ДНК в сперматозоидах [31, 32].

На мышиной модели доказано значение про- и антиапоптотических факторов для нормального клеточного гомеостаза в сперматогенезе. Так, трансгенная сверх-экспрессия Bcl-2 приводила к блокаде клеточной гибели и, вследствие этого, к нарушению нормального сперматогенеза и бесплодию у мышей-самцов [33].

Таким образом, разрывы ДНК, выявляемые в эякуляторных сперматозоидах, могут являться следствием дефекта созревания в ходе сперматогенеза (репарации и ремоделинга). С другой стороны, не исключено, что такие дефекты могут служить факторами запуска апоптоза.

Апоптотические изменения эякуляторных сперматозоидов

Зрелые сперматозоиды обнаруживают признаки апоптоза, несмотря на специфический характер организации хроматина, отсутствие транскрипционной активности и очень малый объем цитоплазмы [34, 35]. Выдвинута модель, в соответствии с которой, несмотря на суперплотную укладку ДНК, зрелые сперматозоиды имеют механизм деградации хроматина благодаря наличию линкерных ДНКазочувствительных участков. Эти участки связывают протаминовые блоки хроматина с ядерным матриксом. Очевидно механизм, приводящий к деградации хроматина сперматозоидов, подобен процессу апоптоза соматических клеток [25].

Апоптотические маркеры зрелых сперматозоидов

Ряд авторов описывают присутствие апоптотических молекулярных маркеров, таких как экстернализация фосфатидилсерина, Fas-экспрессия, активность каспаз, фрагментация ДНК в сперматозоидах здоровых мужчин при нарушениях сперматогенеза [36-41].

В то же время до настоящего времени не ясно, являются ли апоптотические маркеры результатом обратимого апоптотического процесса, начавшегося до эякуляции, или они служат признаком апоптоза, инициированного в постэякуляторный период [6, 42]. Не исключается, что апоптотический процесс сперматозоидов имеет свои особенности, связанные с организацией ДНК и клетки в целом. Есть предположение, что в герминальных клетках, тесно ассоциированных с клетками Сертоли, ДНК подвергается фрагментации без активации каспаз и экстернализации фосфатидилсерина. После освобождения от клеток Сертоли сперматиды и сперматозоиды используют независимый сигнальный путь клеточной гибели [18, 43].

Активация каспаз (внутриклеточных протеаз) и фрагментация ДНК — частый феномен в созревающих половых клетках мужчин с необструктивной азооспермией, особенно в случаях мейотического или постмейотического блоков созревания [43]. Однако присутствие активных каспаз, которые являются классическими компонентами процесса апоптоза в большинстве типов клеток, редко регистрируется в постмейотических половых клетках, и их активность не всегда коррелирует с фрагментацией ДНК [44].

Результаты исследования признаков апоптоза и некроза в отмытых эякуляторных сперматозоидах после инкубации in vitro при 37°C, приводимые в работе [35], свидетельствуют, что ни после 4-, ни после 24-часовой инкубации не происходило возрастания числа апоптотических маркеров (которые оценивали по экстернализации фосфатидилсерина и фрагментации ДНК (TUNEL)). В то же время число некротических клеток возросло после 24-часовой инкубации. На основании этого авторами делается вывод о том, что эякуляторные сперматозоиды не запускают процесс апоптоза по крайней мере в условиях in vitro, и их гибель происходит путем некроза [35].

Апоптотические изменения эякуляторных сперматозоидов могут являться следствием процесса, запущенного в ходе сперматогенеза вследствие генетических нарушений. Так, нарушение сегрегации хромосом, фиксируемое в сверочных точках клеточного цикла, может приводить к переключению на путь апоптоза. В исследовании [7] проанализированы маркеры апоптотических эякуляторных сперматозоидов — носителей хромосомных транслокаций. Обнаружено, что параметры экстернализации фосфатидилсерина и фрагментации ДНК выше в исследуемой группе в сравнении с контрольной [7].

В связи с тем что повреждения ДНК сперматозоидов связывают с процессом апоптоза, многими исследованиями проанализирована взаимосвязь повреждений в ДНК и апоптотических маркеров с активными формами кислорода (АФК) и окислительным стрессом. Высокая степень корреляции отмечается многими авторами [3, 45].

Разрывы ДНК, апоптотические маркеры

и параметры спермограммы

В среднем 20% эякуляторных сперматозоидов мужчин с различными параметрами спермограммы выявляются как апоптотические при исследовании с использованием как аннексина, так и метода TUNEL [38]. В работе [18] установлено, что фрагментация ДНК в эякуляторных сперматозоидах существенно выше, чем в тестикулярных (23% против 4,3%).

Предположение о корреляции между морфологическими параметрами сперматозоидов и фрагментацией ДНК было выдвинуто на основании того, что важная роль апоптоза соматических клеток состоит в устранении дефектных клеток: ДНК разрушается в аномальных сперматозоидах, по аналогии с различными соматическими клетками [46]. По данным [37], апоптотическая фрагментация ДНК ниже в группе мужчин с нормозооспермией в сравнении с группами мужчин с олигоастенотератозооспермией, различной андрологической патологией и тестикулярным раком. Предполагается, что апоптоз служит конечным результатом различных патологических состояний и системой деградации, контролирующей сперматогенез.

Аномалии хроматина сперматозоидов часто ассоциированы с плохими показателями спермограммы, однако многие исследователи констатируют, что параметры фрагментации не имеют четкой корреляции с параметрами спермы, рекомендованными к исследованию ВОЗ (концентрацией, подвижностью, морфологией). По некоторым данным, не выявляется достоверной разницы в апоптотическом индексе между сперматозоидами, определяемыми как нормальные и аномальными по критериям ВОЗ [40]. Сперматозоид, морфологически расцененный как «нормальный», может иметь поврежденную ДНК [47, 48]. Так, в исследовании [49] из 5 пациентов с высоким индексом фрагментации 2 мужчин имели существенные морфологические аномалии сперматозоидов и концентрацию <10·106 в 1 мл. Трое других мужчин имели нормальные параметры спермограммы с концентрацией от 97·106 до 165·106 в 1 мл.

В других исследованиях найдены отрицательные корреляции фрагментации ДНК с характеристиками спермограммы: концентрацией, подвижностью и процентом морфологически аномальных сперматозоидов [48]. Больше всего свидетельств отрицательной корреляции параметров фрагментации ДНК, экстернализации фосфатидилсерина и подвижности [38, 50]. На основании экспериментов с индукцией апоптоза в сперматозоидах предполагается, что подвижность может служить маркером интактной ДНК [51].

Методы исследования фрагментации ДНК

и апоптотических маркеров сперматозоидов

Для оценки повреждений ДНК сперматозоидов и степени апоптотических изменений в клетках предложен ряд подходов, среди которых универсального алгоритма пока не выработано.

SCSA

Одним из наиболее распространенных методов исследования повреждения ДНК является метод SCSA (sperm chromatin structure assay). Он признается наиболее удобным и объективным [6]. Тест основан на метахроматических свойствах акридинового оранжевого, который изменяет флюоресценцию от зеленого до красного в зависимости от того, с одноцепочечной или двухцепочечной молекулой ДНК он связан. Акридиновый оранжевый, связанный с двухцепочечной ДНК, проявляет зеленую флюоресценцию, а связанный с одноцепочечной — красную. Для проникновения акридинового оранжевого в хроматин сперматозоидов используются высокие температуры и низкие pH, деконденсирующие нуклеопротеидную структуру [19]. Метод адаптирован к проточной цитометрии и в таком виде нашел широкое использование в научных исследованиях и в практике репродуктивных центров [52].

С использованием метода SCSA измеряется процент сперматозоидов с высокой чувствительностью к рН-индуцированной денатурации, который обозначается как индекс фрагментации ДНК — DFI (DNA fragmentation index, %). Этот параметр отражает уровень разрывов в ДНК. Кроме DFI, SCSA позволяет идентифицировать процент сперматозоидов с незрелым ядром, имеющим аномальную структуру хроматина. Этот показатель обозначается как HDS (high level of DNA stainability, %). DFI<30% классифицируется как низкий уровень ДНК фрагментации, DFIі30% — высокий уровень. HDS<15% — низкое содержание незрелых сперматозоидов, HDSі15% — высокий уровень незрелых сперматозоидов [19].

TUNEL

Метод TUNEL [terminal deoxynucleotidyl transferases (TdT) dUTP end labeling] служит методом прямого мечения разрывов («ников») в ДНК. Интенсивность люминесценции пропорциональна числу встроенных dUTP и соответственно числу разрывов в ДНК. В качестве флуорохрома обычно используется флюоресцеин. Используется расчет процента TUNEL-позитивных клеток. Применяются модификации метода, например, с использованием антифлюоресцеиновых антител. Метод требует малого числа сперматозоидов. Пациенты, у которых обнаруживают более 10% TUNEL-позитивных сперматозоидов, имеют сниженную результативность ЭКО [19, 48].

Электрофоретические методы

В норме для ДНК характерна высокомолекулярная форма. В ходе апоптоза в соматических клетках ДНК подвергается эндонуклеазному межнуклеосомному расщеплению на фрагменты (до 180-200 н.п.), что выявляется электрофоретически в образцах выделенной из клеток ДНК с окрашиванием бромида этидием (DNA ladder assay). Характерный для большинства апоптотических клеток рисунок фрагментов ДНК — «лестница» — не выявляется для сперматозоидов, однако высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции ДНК могут быть идентифицированы электрофоретически [19].

Электрофорез на единичных клетках, получивший название «Comet Assay», позволяет определить содержание высоко- и низкомолекулярной ДНК по ареалу низкомолекулярной ДНК, напоминающей хвост кометы, получаемого при мини-электрофорезе клеток, иммобилизованных в агарозном геле. Применяется специфическая обработка клеток с использованием протеиназы К. Результатом служит число клеток с «кометным хвостом» относительно общего числа клеток. Также измеряется длина хвоста [53, 54].

Проведены специальные исследования, посвященные сопоставлению различных методов оценки целостности ДНК. Показано, что результаты Сomet-анализа коррелируют с результатами TUNEL и SCSA [55].

Исследование апоптотических маркеров

Самый распространенный апоптотический маркер, применяющийся для оценки состояния сперматозоидов, — аннексин, являющийся кальцийзависимым белком, обладающим высокой аффинностью к фосфатидилсерину. Аннексин, связанный с каким-либо флюоресцентным красителем, позволяет детектировать транслокацию фосфатидилсерина на внешнюю сторону плазматической мембраны (экстернализацию) при апоптозе [3, 35, 56]. Присутствие аннексина служит ранним признаком апоптоза. Апоптотическими являются около 20% эякуляторных сперматозоидов по оценкам, полученным путем определения с помощью аннексина [46].

Определение наличия апоптотических маркеров в популяции сперматозоидов предполагает использование дополнительных красителей, позволяющих детектировать живые и некротические клетки. Некротические клетки определяют с помощью пропидиума йодида, который проникает только в погибшие клетки через поврежденную при некрозе мембрану. Зная число окрашенных апоптотических и некротических клеток, можно рассчитать апоптотический индекс: соотношение апоптотических и живых сперматозоидов [3, 35, 40].

Исследования, в которых производился анализ с использованием аннексина и методов детекции разрывов в ДНК, таких, например, как TUNEL, доказывают наличие корреляции экстернализации фосфатидилсерина и разрывов в ДНК в сперматозоидах [3].

Для исследования одного из ключевых событий при апоптозе — деполяризации митохондриальной мембраны — могут быть использованы различные флюоресцентные красители, чувствительные к мембранному потенциалу митохондрий. Rhodamine 123, carbocyanin DiOC2, DilC1 используются в качестве зондов, поскольку аккумулируются в митохондриях. Исследованию изменения митохондриального потенциала (Dym), вовлеченного в апоптоз в сперматозоидах, посвящено немного исследований. По данным [57], сперматозоиды с высоким уровнем митохондриального потенциала имели низкий уровень фрагментации ДНК.

В соматических клетках конденсированный хроматин апоптотических клеток определяют с помощью флюоресцентного красителя Hoescht 33342, который в апоптотических клетках ярче, чем в живых. Исследование апоптоза в сперматозоидах с помощью такого метода несколько затруднено из-за того, что упаковка хроматина в них и так достаточно плотная. Однако некоторые авторы используют этот метод для определения апоптоза в мужских половых клетках [58].

Одно из ключевых событий при апоптозе — повреждение митохондрий с повышением проницаемости митохондриальных мембран. Митохондрия содержит «коктейль» проапоптотических и антиапоптотических белков, высвобождение которых в цитоплазму клетки приводит к реализации апоптоза или ингибирует его. Определение уровня таких белков, в частности семейства Bcl, применяется для исследования инициации апоптотического состояния клеток [59].

Характерной чертой апоптоза является увеличение активности каспаз. Активность каспаз определяют главным образом с помощью иммуннофлюоресцентного метода [59, 60].

Фрагментация ДНК в сперматозоидах, фертильность и репродукция

Во многих исследованиях установлено негативное действие высокого процента поврежденной ДНК в сперматозоидах на частоту наступления беременности [2, 48, 53, 54, 61-63]. Такие данные получены в исследованиях при использовании методов ВРТ. Авторы этих работ полагают, что повреждения ДНК могут служить диагностическим маркером негативного отцовского эффекта в отношении преимплантационного развития человека.

Влияние разрывов ДНК на оплодотворение

in vitro, преимплантационное развитие эмбриона, имплантацию и наступление беременности

Сперматозоиды даже со значительным уровнем повреждений ДНК сохраняют способность оплодотворять ооциты. Однако в дальнейшем эмбриональное развитие может блокироваться на разных этапах. Многие авторы доказывают, что фрагментация ДНК не оказывает влияния на оплодотворение, но имеет важное значение для формирования бластоцист и имплантации. Необходимо отметить, что ни один из рекомендованных ВОЗ параметров спермы, таких как объем, число сперматозоидов, подвижность, морфология не дают прогноза низкой частоты формирования бластоцист [10, 48, 64].

Результаты работы [65] свидетельствуют о том, что частота наступления беременности в программах ЭКО/ИКСИ не различалась в группах с высоким и низким индексом фрагментации ДНК (DFI). В супружеских парах, где мужчины имели высокий уровень фрагментации ДНК (DFIі30%), была низкой частота формирования бластоцист (<30%) и частота наступления беременности в циклах ЭКО и ИКСИ, а также повышенная вероятность абортов. При этом не выявлено значимой взаимосвязи высокого содержания незрелых сперматозоидов (HDSі15%) и низкой частоты формирования бластоцист. Также не выявлено взаимосвязи HDS и частоты имплантации, наступления беременности и спонтанных абортов. По мнению авторов, популяция незрелых сперматозоидов не ассоциирована с повышенной фрагментацией ДНК. Среди случаев, в которых обычный анализ спермы не выявляет аномалий, 18% мужчин имеют DFIі30% и соответственно плохие шансы формирования бластоцист и положительного исхода ЭКО/ИКСИ. В то же время 39% мужчин с аномальными параметрами спермограммы не имеют повышенного уровня фрагментации ДНК. Они имеют хорошие шансы для достижения супружеской парой беременности в циклах ЭКО и ИКСИ [65].

Ассоциации между целостностью ДНК эякуляторных сперматозоидов и частотой оплодотворения в ЭКО и ИКСИ не выявлено при использовании SSCA [63, 66], TUNEL [10] и Comet-анализов [53].

В противоположность таким исследованиям некоторыми авторами установлена отрицательная корреляция между разрывами ДНК и вероятностью оплодотворения при ЭКО и ИКСИ [16, 48]. Так, в исследовании [48] выявлено, что при фрагментации ДНК >10% (выявленной методом TUNEL) снижается частота оплодотворения, при этом взаимосвязи с морфологией эмбрионов не найдено.

Отсутствие ассоциации фрагментации ДНК со снижением частоты оплодотворения, обнаруженное многими авторами, находится в соответствии с представлением о том, что нарушения в отцовской ДНК не проявляются до активации эмбрионального генома, которая начинается на 4-клеточной стадии у человека. Высокий уровень фрагментации ДНК манифестирует при формировании бластоцисты [42, 65].

В работе [67] исследован вопрос о раннем или позднем отцовском эффекте фрагментации ДНК (анализ производился методом TUNEL) на эмбрионы человека. Ранний эффект рассматривался авторами для группы, в которой <25% полученных зигот были с хорошей морфологией. При позднем эффекте 50% зигот имели нормальную морфологию. Ранний отцовский эффект возможен на зиготической стадии. Такой эффект должен осуществляться до активации экспрессии отцовского генома. Проведенные исследования доказывают, что фрагментация ДНК не имеет раннего эффекта и не ассоциирована с аномалиями зиготы и раннего дробления [67].

Исследования [63] показывают, что в супружеских парах, в которых беременность наступила в циклах ЭКО/ИКСИ, мужчины имели более низкие параметры фрагментации ДНК, чем в тех, где беременность не наступила. Кроме того, ни одной беременности не было получено при показателе фрагментации і27%. На основании полученных данных делается вывод о том, что индекс фрагментации і27%, полученный с помощью SCSA-анализа, служит фактором, предсказывающим отрицательный результат для наступления беременности [63].

С использованием SCSA выявлена устойчивая взаимосвязь индекса фрагментации ДНК более 27-30% и снижения частоты наступления беременности при ВРТ [66].

В то же время необходимо отметить, что данные, получаемые разными авторами, разноречивы. В работе [68] проверялась гипотеза о том, что супружеские пары со значением DFI>27% не могут достичь беременности при использовании ЭКО/ИКСИ. Гипотеза не нашла подтверждения в исследовании: беременности для супружеских пар с параметрами DFI>27% были получены, и автором был сделан вывод о неудовлетворительности использования метода SCSA для прогноза исходов ВРТ. Эта работа вызвала большой отклик и вовлекла в полемику ряд исследователей на страницах журнала «Fertility and Sterility» [69, 70].

По данным [71], фрагментация ДНК сперматозоидов не оказывает влияние на исходы беременности при использовании внутриматочной инсеминации. В исследовании [72] не выявлено достоверной разницы как в частоте наступления беременности после ИКСИ, так в и частоте оплодотворения между группами с высоким процентом повреждений ДНК и низкими. Однако при высоком количестве повреждений выявлена повышенная частота спонтанных абортов. По мнению авторов, отцовский эффект, связанный с повреждениями ДНК, может оказывать влияние на качество эмбрионов.

Подходы к преодолению высокого уровня фрагментации в ДНК

Преодоление высокого уровня фрагментации ДНК в сперматозоидах с помощью различных подходов описывается в ряде исследований. Одним из вариантов лечения для пар с высоким процентом фрагментации ДНК, особенно при плохом качестве бластоцист и неудачных циклах, может служить донация сперматозоидов [65].

Технологии обработки спермы, такие как «PureSperm» и «Percoll», способствуют обогащению образца спермы клетками с интактной нормально упакованной ДНК [73]. Сравнение различных методов подготовки спермы доказывает, что наиболее эффективным методом элиминации неживых и апоптотических сперматозоидов является процедура swim-up [74, 75] в сравнении с градиентным центрифугированием и простой отмывкой от семенной плазмы [35].

Для преодоления высоких показателей фрагментации ДНК в эякуляторных сперматозоидах предложен способ лечения с применением тестикулярных сперматозоидов [18]. Сравнение уровня фрагментации, веденное с использованием TUNEL, доказывает, что тестикулярные сперматозоиды имеют значительно более низкие показатели, чем эякуляторные. При использовании тестикулярных и эякуляторных сперматозоидов не выявлено разницы между частотами оплодотворения и эффективностью дробления. Однако значительная разница получена для частоты беременности: при использовании тестикулярных сперматозоидов этот параметр составил 44,4%, а при использовании эякуляторных получена только одна беременность, прервавшаяся спонтанным абортом [18].

В эксперименте [39] предпринята проверка гипотезы о том, что ассоциированные с апоптозом дефекты тестикулярных сперматозоидов пациентов с необструктивной азооспермией можно убрать культивированием in vitro. Достигнуто снижение количества разрывов ДНК (30% после культивирования против 96% до него) и уровня экстернализации фосфатидилсерина во фракции подвижных сперматозоидов (6% против 83%). Получены 7 клинических беременностей у 11 пациентов, которые все имели в анамнезе по две безуспешные попытки ИКСИ.

В работе [76] описываются случаи, когда преодоление бесплодия для нескольких супружеских пар с DFI>30% удалось достичь в программах ИКСИ с использованием антиоксидантной терапии. При этом использовалась терапия «Fertility Blend™», включающая L-карнитин и другие антиоксиданты.

Заключение

Обзор исследований, посвященных фрагментации ДНК сперматозоидов, позволяет заключить, что этот параметр имеет самостоятельное диагностическое и прогностическое значение для пациентов с бесплодием, прибегающим к ВРТ. Несмотря на то что механизмы образования разрывов не до конца ясны, исследование фрагментации ДНК сперматозоидов может улучшить анализ спермы и служить эффективным прогностическим инструментом, выявляющим мужской фактор нарушения фертильности.

 

Литература

1. Oehninger S., Chaturvedi S., Toner J. et al. Semen quality is there a paternal effect on pregnancy outcome in in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection? Hum Reprod 1998; 13: 2161-2164.

2. Tesarik J., Mendoza C., Greco E. Paternal effects acting during the first cell cycle of human preimplantation development after ICSI. Hum Reprod 2002; 17: 184-189.

3. Barroso G., Morshedi M., Oehninger S. Analysis of DNA fragmentation, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and oxidative stress in human spermatozoa. Hum Reprod 2000; 15, 6: 1338-1344.

4. Baker M., Aitken R.J. Reactive oxygen species in spermatozoa: methods for monitoring and significance for the origins of genetic disease and infertility. Reprod Biol Endocrinol 2005; 3, 67: 1477-7827.

5. Findikli N., Kahraman S., Kumtepe Y. Assessment of DNA fragmentation and aneuploidy on poor quality human embryos. Reprod Biomed Online 2004; 8, 2: 196-206.

6. Seli E., Sakkas D. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART. Hum Reprod Update 2005; 11: 4: 337-349.

7. Brugnon F., Van Assche E., Verheyen G. et al. Study of two markers of apoptosis and meiotic segregation in ejaculated sperm of chromosomal translocation carrier patients. Hum Reprod 2006; 21: 3: 683-685.

8. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А. Значение анализа организации хроматина ядер сперматозоидов в диагностике мужского бесплодия. Пробл репрод 1997; 4: 23-27.

9. Воробьева О.А., Воскресенская А.В., Одинцов А.А., Филатов М.В. Мужское бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов. Существует ли связь? Пробл репрод 2005; 6: 56-62.

10. Ahmadi A., Ng S.C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J Exp Zool 1999; 284: 696-704.

11. Sakkas D. The use of blastocyst culture to avoid inheritance of an abnormal paternal genome after ICSI. Hum Reprod 1999; 14: 4-5.

12. Carrell D.T., Liu L., Peterson C.M. et al. Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Arch Androl 2003; 49: 49-55.

13. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M. et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology. Reprod Biomed Online 2003; 7: 477-484.

14. Henkel R., Hajimohammad M., Stalf T. et al. Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy. Fertil Steril 2004; 81: 965-972.

15. Agarwal A., Said T.M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Hum Reprod 2003; 19: 4: 331-345.

16. Sun J.G., Jurisicova A., Casper R.F. Detection of deoxyribonucleic acid fragmentation in human sperm: correlation with fertilization in vitro. Biol Reprod 1997; 56: 602-607.

17. Irvine D.S., Twigg J.P., Gordon E.L. et al. DNA integrity in human spermatozoa relationships with semen quality. J Androl 2000; 21: 33-44.

18. Greco E., Scarselli F., Iacobelli M. et al. Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicular spermatozoa. Hum Reprod 2004; 20: 1: 226-230.

19. Schlegel P.N., Paduch D.A. Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil Steril 2005; 84: 4: 854-859.

20. Fuentes-Mascorro G., Serrano H., Rosado A. Sperm chromatin. Arch Androl 2000; 45: 215-225.

21. Olsen A.-K., Lindeman B., Wiger R., Duale N., Brunborg G. How do male germ cells handle DNA damage? Toxicol Appl Pharmacol 2005; 207: 2: 521-531.

22. Rousseaux S., Caron C., Govin J. et al. Establishment of male-specific epigenetic information. Gene 2005; 345, 2: 31: 139-153.

23. Govin J., Caron C., Lestrat C. et al. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur J Biochem 2004; 271: 3459-3469.

24. Vilfan I.D., Conwell C.C., Hud N.V. Formation of native-like mammalian sperm cell chromatin with folded bull protamine. J Biol Chem 2004; 279: 9: 20088-20095.

25. Sotolongo В., Lino E., Ward W.S. Ability of hamster spermatozoa to digest their own DNA. Biol Reprod 2003; 69: 2029-2035.

26. Wykes S.M., Krawetz S.A. The structural organization of sperm chromatin. J Biol Chem 2003; 278, 32: 29471-29477.

27. Cho С., Jung-Ha H., Willis W.D. et al. Protamine 2 deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice. Biol Reprod 2003; 69: 211-217.

28. Boissonneault G. Chromatin remodeling during spermiogenesis: a possible role for the transition proteins in DNA strand break repair. FEBS Letters 2002; 514: 2-3: 11-114.

29. Oldereid N.B., Angelis P.D., Wiger R., Clausen O.P. Expression of Bcl-2 family proteins and spontaneous apoptosis in normal human testis. Mol Hum Reprod 2001; 7: 403-408.

30. Spierings D.C., de Vries E.G., Vellenga E., de Jong S. The attractive Achilles heel of germ cell tumours: an inherent sensitivity to apoptosis-inducing stimuli. J Pathol 2003; 200: 137-148.

31. Fraga C.G., Motchnik P.A., Wyrobek A.J. et al. Smoking and low antioxidant levels increase oxidative damage to sperm DNA. Mutat Res 1996; 351: 199-203.

32. Potts R.J., Newbury C.J., Smith G. et al. Sperm chromatin damage associated with male smoking. Mutat Res 1999; 423: 103-111.

33. Furuchi T., Masuko K., Nishimune Y. et al. Inhibition of testicular germ cell apoptosis and differentiation in mice misexpressing Bcl-2 in spermatogonia. Development 1996; 122: 1703-1709.

34. Blanc-Layrac G., Bringuier A.F., Guillot R., Feldmann G. Morphological and biochemical analysis of cell death in human ejaculated spermatozoa. Cell Mol Biol 2000; 46: 1: 187-197.

35. Lachaud С., Tesarik J., Caсadas M.L., Mendoza C. Apoptosis and necrosis in human ejaculated spermatozoa. Hum Reprod 2004; 19: 3: 607-610.

36. Sakkas D., Mariethoz E., St John J.C. Abnormal sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway. Exp Cell Res 1999; 15: 251: 2: 350-355.

37. Gandini L., Lombardo F., Paoli D. et al. Study of apoptotic DNA fragmentation in human spermatozoa. Hum Reprod 2000; 15: 4: 830-839.

38. Oosterhuis G.J., Mulder A.B., Kalsbeek-Batenburg E. et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality? Fertil Steril 2000; 74: 2: 245-250.

39. Tesarik J., Greco E., Mendoza C. Assisted reproduction with in-vitro-cultured testicular spermatozoa in cases of severe germ cell apoptosis: a pilot study. Hum Reprod 2001; 16: 2640-2645.

40. Ricci G., Perticarari S., Fragonas E. et al. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Hum Reprod 2002; 17: 10: 2665-2672.

41. Weng S.-L., Taylor S.L., Morshedi M. et al. Caspase activity and apoptotic markers in ejaculated human sperm. Mol Hum Reprod 2002; 8: 11: 984-991.

42. Sakkas D., Mariethoz E., Manicardi G. et al. Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa. Rev Reprod 1999; 4: 31-37.

43. Tesarik J., Ubaldi F., Rienzi L. et al. Caspase-dependent and -independent DNA fragmentation in Sertoli and germ cells from men with primary testicular failure: relationship with histological diagnosis Hum Reprod 2004; 19: 2: 254-261.

44. Tesarik J., Martinez F., Rienzi L. et al. In-vitro effects of FSH and testosterone withdrawal on caspase activation and DNA fragmentation in different cell types of human seminiferous epithelium. Hum Reprod 2002; 17: 1811-1819.

45. Aitken R.J., Krausz C. Oxidative stress, DNA damade and Y chromosome. Reproduction 2001; 122: 497-506.

46. Wang X., Sharma R.K., Sikka S.C. et al. Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility. Fertil Steril 2003; 80: 3; 531-535.

47. Lopes S., Sun J.G., Jurisicova A. et al. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1998; 69: 528-532.

48. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003; 18: 5:1023-1028.

49. Buyalos R., Hubert G., Schiewe M.C. Poor fertility predictive value of the sperm chromatin structure assay (SCSA) is neutralized by sperm injection: case studies. Fertil Steril 2004; 81: (Suppl 3): 27-28.

50. Giwercman A., Richthoff J., Hjшllund H. et al. Correlation between sperm motility and sperm chromatin structure assay parameters. Fertil Steril 2003; 80: 6: 1404-1412.

51. Ramos L., Wetzels A.M.M. Low rates of DNA fragmentation in selected motile human spermatozoa assessed by the TUNEL assay. Hum Reprod 2001; 16: 8: 1703-1707.

52. Evenson D.P., Jost L.K., Marshall D. et al. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 1999; 14: 1039-1049.

53. Morris I.D., Ilott S., Dixon L., Brison D.R. The spectrum of DNA damage in human sperm assessed by single cell gel electrophoresis (Comet assay) and its relationship to fertilization and embryo development. Hum Reprod 2002; 17: 990-998.

54. Tomsu M., Sharma V., Miller D. Embryo quality and IVF treatment outcomes may correlate with different sperm comet assay parameters. Hum Reprod 2002; 17: 7: 1856-1862.

55. Erenpreiss J., Jepson K., Giwercman A. et al. Toluidine blue cytometry test for sperm DNA conformation comparison with the flow cytometric sperm chromatin structure and TUNEL assays. Hum Reprod 2004; 19: 2277-2282.

56. Martin S.J., Reutelingsperger C.E.M., McGahon A.J. et al. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J Exp Med 1995; 182: 1545-1556.

57. Marchetti C., Guillaume O., Deffosez A. et al. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Hum Reprod 2002; 17: 5: 1257-1265.

58. Rowland S.C., Jacobson J.D., Patton W.C. et al. Dual fluorescence analysis of DNA apoptosis in sperm. Am J Obstet Gynecol 2003; 188: 5: 1156-1157.

59. Cayli S., Sakkas D., Vigue L. et al. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatine kinase, caspase-3 and Bcl-XL levels in mature and diminished maturity sperm. Mol Hum Reprod 2004; 10: 5: 365-372.

60. Oehninger S. Caspase activity and apoptotic markers in ejaculated human sperm. Mol Hum Reprod 2002; 8: 11: 984-991.

61. Filatov M.V., Semenova E.V., Vorob’eva O.A. et al. Relationship between abnormal sperm chromatin packing and IVF results. Mol Hum Reprod 1999; 5: 825-830.

62. Host E., Lindenberg S., Smidt-Jensen S. The role of DNA strand breaks in human spermatozoa used for IVF and ICSI. Acta Obstet Gynecol Scand 2000; 79: 559-563.

63. Larson K.L., DeJonge C.J., Barnes A.M. et al. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod 2000; 15: 8: 1717-1722.

64. Seli E., Gargner D.K., Schoolcraft W.B. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization. Fertil Steril 2004; 82: 378-383.

65. Virro M.R., Larson-Cook K.L., Evenson D.P. Sperm chromatin structure assay (scsa) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril 2004; 81: 5: 1289-1295.

66. Larson-Cook K.L., Brannian J.D., Hansen K.A. et al. Relationship between the outcomes of assisted reproductive techniques and sperm DNA fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay. Fertil Steril 2003; 80: 4: 895-902.

67. Tesarik J., Greco E., Mendoza C. Late, but not early, paternal effect on human embryo development is related to sperm DNA fragmentation. Hum Reprod 2004; 19: 3: 611-615.

68. Payne J.F., Raburn D.J., Couchman G.M. et al. Redefining the relationship between sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay and outcomes of assisted reproductive techniques. Fertil Steril 2005; 84: 2: 356-364.

69. Check J.H., Choe J.K. Predictive value of the sperm chromatin assay in different populations. Hum Reprod 2006; 85: 3: 809.

70. Evenson D.P., Wixon R. Predictive value of the sperm chromatin assay in different populations. Hum Reprod 2006; 85: 3: 810-811.

71. Muriel L., Meseguer M., Fernбndez J.L. et al. Value of the sperm chromatin dispersion test in predicting pregnancy outcome in intrauterine insemination: a blind prospective study. Hum Reprod 2006; 21: 3: 738-744.

72. Zini A., Meriano J., Kader K. et al. Potential adverse effect of sperm DNA damage on embryo quality after ICSI. Hum Reprod 2005; 20: 12: 3476-3480.

73. Sakkas D., Manicardi G.C., Tomlinson M. et al. The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies. Hum Reprod 2000; 15: 5: 1112-1116.

74. Zini A., Finelli A., Phang D., Jarvi K. Influence of semen processing technique on human sperm DNA integrity. Urology 2000; 56: 1081-1084.

75. Younglai E.V., Holt D., Brown P. et al. Sperm swim-up techniques and DNA fragmentation. Hum Reprod 2001; 16: 1950-1953.

76. Barnes F., Rabara F., Murphy A., Zouves C. Live births after IVF in men with a DNA fragmentation index of 30% or greater as determined by the sperm chromatin structure assay (SCSA™). Fertil Steril 2004; 82: (Suppl 2): S47.

Забор бластомера для предимплантационной (предгравидарной) диагностики позволяет выносить беременность и иметь здорового ребенка парам с генетической патологией (муковисцидоз, сахарный диабет 1-го типа и т.п.)

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Так выглядит ICSI

Так выглядит ICSI (введение сперматозоида непосредственно в яйцеклетку)

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Внутриматочная инсеминация

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Ингибиторы ароматазы, как индукторы овуляции, используются все чаще и чаще.

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Механизм действия кломифен цитрата

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Симптом папоротника

Симптом папоротника — «арборизация» шеечной слизи в периовуляторный период за счет повышенного содержания хлорида натрия

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Хромопертубация во время лапароскопии

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

Сперматогенез

Более подробная информация на различные темы акушерства и гинекологии на сайте: http://drmedvedev.com/

 

О проекте

Сайт, созданный фанатами своей любимой профессии - акушерства и гинекологии. Для пациенток, врачей и всех кто интересуется.

Прочее